سیم ظرفشویی کلافی که به صورت خودکار ظرف ها را می شوید

توالی یابی باکتری سیم ظرفشویی نازک و پردازش داده ها برای همه نمونه ها، PCR در سه تکرار انجام شد و توالی یابی انتهای جفتی (2×150 جفت باز) با استفاده از پروتکل ارائه شده در Caporaso و همکاران انجام شد. (2012).

به طور خلاصه، ناحیه V4 ژن 16S rRNA با آغازگرهای مخصوص ناحیه (515F (Parada et al., 2016)، 806R (Apprill et al., 2015)) که شامل توالی های آداپتور سلول جریان Illumina (Apprill et al.) بود، تقویت شد.

2015؛ پارادا و همکاران، 2016). پرایمر تقویت پیشرو نیز حاوی یک توالی بارکد پایه دوازده بود که از ادغام نمونه های مختلف پشتیبانی می کند.

نمونه ها با Ampure (شرکت Agencourt Bioscience) خالص شدند و با استفاده از Quant-iT Picogreen ds DNA با picogreen قبل از ادغام کمی شدند.

مخزن نمونه همانطور که در بالا توضیح داده شد، خالص و کمی شد، تا 4 نانومتر رقیق شد و با استفاده از کیت معرف MiSeq v3 روی یک MiSeq (Illumina) طبق پروتکل ارائه شده توسط Illumina تعیین توالی شد.

علاوه بر نمونه‌های آزمایشی، اجرای MiSeq همچنین حاوی یک کتابخانه کنترلی ساخته شده از phiX Control v3 بود که در این اجرا 10 درصد از خوانده‌ها را به خود اختصاص داد. کمی سازی و توالی یابی کتابخانه در نوفیما انجام شد. نسخه نرم افزار کنترل MiSeq (MCS) مورد استفاده RTA v1.18.54 بود.

توالی ها در QIIME2 (qiime2-2019.1) پردازش شدند. به طور خلاصه، داده ها عبارت بودند از: Demultiplexed با استفاده از demux، انتهای جفت شده با استفاده از vsearch، کیفیت فیلتر بر اساس Q-score بالای 30، حذف نویز با استفاده از deblur، و طبقه بندی با استفاده از classify-sklearn با پایگاه داده Greengenes 16S 13_8 به دست آمد

Amir et al. .، 2017؛ بوکلیچ و همکاران، 2018؛ بولین و همکاران، 2019؛ مک دونالد و همکاران، 2012؛ پدرگوسا و همکاران، 2011).

توالی‌هایی که از میتوکندری‌ها و کلروپلاست‌ها سرچشمه می‌گیرند (خیلی کم) از مجموعه داده نهایی فیلتر شدند.

جدول طبقه بندی و ویژگی ها به فایل های متنی صادر شد و در اکسل پردازش شد. توالی های نماینده غالب با توالی لکه های تلقیح شده برای تایید هویت گونه مقایسه شدند. توالی‌های نشان‌دهنده انتروباکتریاسه نیز به جستجوی نوکلئوتید BLAST برای دریافت اطلاعات بیشتر در مورد جنس‌های احتمالی ارسال شدند.